Введение
     В настоящее время тетрапиррольные соединения (например, порфирины и производные ряда хлорофилла) вызывают большой интерес с точки зрения терапии злокачественных новообразований. В течение последнего десятилетия сформировался соответствующий клинический подход, именуемый фотодинамической терапией опухолей (ФДТ), состоящий в последовательных операциях системного или местного введения соединения (фотосенсибилизатора, ФС) в организм и лазерного облучения опухоли на длине волны, соответствующей одному из максимумов поглощения ФС (как правило, длинноволновому). Одной из проблем такого подхода является повышение селективности накопления ФС в опухоли, так как следствием низкой селективности является невысокая эффективность лечения и повышенная чувствительность кожи к дневному свету.
     С целью повышения этой селективности использовались такие приемы, как:

• химическая модификация периферических заместителей ФС - актуальное и бурно развивающееся направление химии тетрапиррольных соединений, по которому ежегодное количество публикаций составляет несколько сотен;
• ковалентное присоединение ФС к моноклональным антителам против опухолеассоциированных антигенов;
• образование нековалентных комплексов ФС с липопротеинами;
• использование ФС в виде липосомных препаратов;
• доставка с помощью векторов, способных селективно связываться с клеточными органеллами раковых клеток.

В области синтетических работ по химии тетрапирролов имеется тенденция к созданию соединений с заданными свойствами на основе так называемого структурно-функционального подхода. Этот подход применим, в частности, к конструированию и получению новых фотосенсибилизаторов (ФС) для фотодинамической терапии опухолей (ФДТ), характеризующихся повышенной туморотропностью и высокой эффективностью разрушения опухолевой ткани при облучении.

Тетрапиррольные соединения, как фотосенсибилизатор для ФДТ рака
     В 1908 г. В. Хаузманн впервые подробно описал действие тетрапиррольного ФС гематопорфирина-IХ (Рис.1), получаемого из крови, на клетки и животных.

В 1913 г. Ф. Мейер-Бетц ввел себе гематопорфирин-IХ, чтобы изучить его биологическое действие. Его работа, как и работа его предшественника, не вызвала резонанса в области клинических исследований рака, но способствовала интенсивному исследованию процессов фотодинамического разрушения (фотодеструкции) клеток.

В 1942 г. X.Аулер и Г.Банцер сообщили о сродстве гематопорфирина-IХ к новообразованиям, что позже было подтверждено в работе Фигге и сотр. (1948), где обсуждалась флюоресценция опухолеассоциированных порфиринов под лампой Вуда. Дальнейшее развитие ФДТ было в основном связано с олигомерными производными гематопорфирина-IХ.

В 1970-х г.г. (Д.Кессель, 1977) были in vitro исследованы на предмет фотоцитотоксичности наиболее распространенные порфирины (протопорфирин-IХ, гематопорфирин-IХ, дейтеропорфирин-IХ, 2,4-диацетилдейтеропорфирин-IХ, мезопорфирин-IХ и ряд других), а в 1980-х синтезировано большое число разноообразных 2,4-ди (a-алкоксиэтильных) производных гематопорфирина-IХ (подробнее см. в обзоре. Наибольшую активность проявили порфирины, обладающие промежуточной полярностью, причем активность возрастала с ростом липофильности (увеличение размеров заместителей от С1 к С5). Было показано, что на туморотропность влияет не только природа макроцикла, но и размеры противоиона для анионных ФС. Например, высокая тропность к опухолям обнаружена нами у некоторых солей 2,4-бис-(а-метоксиэтил)дейтеропорфирина-IХ ("Димегина") 1: (R1=R2=-ОМе): кратность накопления в опухолях по сравнению с окружающими тканями составляла 16 - 30. У гематопорфирина-IХ эта величина была в пределах 2-10.

Среди прочих производных порфиринов значительное внимание в литературе уделялось сульфированным производным тетрафенилпорфина (ТРРS_Х). Из них большой интерес исследователей вызывал порфин, содержащий в пора-положениях 4-х мезо-фенильных заместителей сульфогруппы, - ТРРS₄ 5: (R₁=R₂=Rз=R4=-Рh(р)SОзН). Были получены и использованы для ФДТ in vitro первые N-алкилированные производные мезо-тетра[пиридил]порфина.

Насколько нам известно, первое упоминание в научной литературе об использовании производных хлоринового ряда для ФДТ относится к 1986 г., когда группа авторов (Дж. Боммер, Ж. Швейда и Б. Бирнхем) сообщила о результататах своего поиска ФС, удовлетворяющего важнейшим требованиям ФДТ, а именно хорошей туморотропности и интенсивному поглощению в длинноволновой красной области спектра. Им оказался моно-L-аспартил хлорин е6 2: (R₁=Vi, R₂=СОАsр, R₃=СН₂СООН, R₄=СООН). Фактически же впервые рассматривать производные феофорбида 3: (R₁=Vi, R₂=СОOH, R₃=СН₂СООMe) в качестве потенциальных ФС для ФДТ начали в 1984 г. в Японии (И. Саката и сотр.). Одновременно в США Дж.Боммером и Б.Бирнхемом для японской компании Nippon Petrochemicals Company был заявлен для патентования ряд производных хлорина е6 2: (R₁=Vi, R₂=СОOH, R₃=СН₂СООН, R₄=СООН). и бактериофеофорбида a 4_1(К=СООН) как ФС для ФДТ.

Одной из актуальных задач оптимального проведения фотодинамической терапии является поиск ФС, способного обеспечить эффективное практическое использование этого метода. По мере накопления экспериментального и клинического материала были сформулированы основные требования к оптимальному ФС, включающие биологические (токсические и фармакокинетические), фотофизические и химико-технологические критерии. Прежде всего это:

• низкая темновая и световая токсичность в терапевтических дозах;
• высокая селективность накопления в тканях злокачественных новообразований и быстрое выведение фотосенсибилизатора из кожи и эпителиальной ткани;
• сильное поглощение в спектральном диапазоне, где биологические ткани имеют наибольшее пропускание (красный и ближний ИК диапазоны);
• оптимум между величинами квантового выхода флуоресценции и квантового выхода интерконверсии, второй из которых определяет способность ФС к генерации синглетного кислорода (в то же время способность ФС флуоресцировать обусловливает его диагностические возможности и облегчает контроль накопления и выведения его из тканей);
• высокий квантовый выход образования синглетного кислорода;
• доступность получения или синтеза, однородный химический состав;
• хорошая растворимость в воде или разрешенных для внутривенного введения жидкостях и кровезаменителях;
• стабильность при световом воздействии и хранении.

Основное ограничение метода ФДТ - глубина воздействия. Используемые в клинике препараты имеют спектр фото динамического воздействия с максимумами в области 620 - 675 нм. Проницаемость биологических тканей в этом диапазоне незначительна и составляет несколько миллиметров. Максимальная проницаемость тканей находится в дальней красной и ближней ИК области 750 - 1500 нм и соответствует диапазону генерации эффективных, надежно работающих и доступных лазеров. Создание и внедрение ФС, обеспечивающих эффективную генерацию синглетного кислорода в этой области спектра, могло бы расширить сферу применения ФДТ. В настоящее время проводится направленный поиск таких ФС среди производных хлоринов, бактериохлоринов, пурпуринов, бензопорфиринов, тексафиринов, этиопурпуринов, нафтало- и фталоцианинов. При этом особый интерес представляют ФС, обладающие способностью быстро аккумулироваться в опухоли и высокой скоростью катаболизма. Со временем, как это демонстрирует история химиотерапии опухолей, будет создан банк ФД препаратов адресного спектра применения, адаптированных к определенным нозологическим и гистологическим формам рака.

Нами проводятся систематические исследования тетрапиррольных макроциклов хлоринового ряда (производных хлорофилла a) с целью выявления структурно-функциональных закономерностей накопления фотосенсибилизаторов в опухоли, повышения терапевтического отношения, создания на их основе лекарственных субстанций и форм, их всестороннего доклинического изучения и последующего внедрения лучших соединений в клиническую практику ФДТ.

Фотофизические свойства
     В первую очередь для соединений с предполагаемой биологической активностью нами исследуются их фотофизические свойства в различных средах (табл.1).

От свойства вещества флюоресцировать зависит его способность генерировать активные токсические факторы при облучении. Чем меньше флюоресценция, тем выше квантовый выход интерконверсии, и тем выше фотодинамическое действие ФС при прочих равных условиях. Однако, для целей флюоресцентной диагностики опухолей при избирательном накоплении в них ФС, необходимо сохранять у соединения некоторую, пусть небольшую, способность флюоресцировать (табл.2).

Цитотоксичность и цитофототоксичность in vitro
     Для дальнейшего определения пригодности соединения для использования в качестве эффективного ФС для ФДТ определяются его коэффициент распределения в системе октанол/буферный раствор, цитотоксичность и цитофототоксичность in vitro (табл.3).

Согласно литературным данным наибольшую эффективность в качестве ФС для ФДТ проявляют амфифильные соединения, для которых коэффициент распределения в системе 1-октанол/фосфатный буфер с рН 7.4 (К_р) больше 1. Для приведенных в табл.3 ФС этот показатель находится в диапазоне от 1 до 53, что, при полном сохранении водорастворимости, является признаком перспективности дальнейшего изучения свойств этих соединений.

Исследование влияния на клеточное деление и цитофототоксической активности синтезированных соединений проводилось in vitro путем МТТ-теста в культуре клеток феохромоцитомы крысы (линия РС 12). Препаратом сравнения служил разрешенный для клинического тестирования препарат "Фотосенс" (ГНЦ РФ НИОПИК). Для возбуждения ФС был использован лазер SHG YAP:2 с длинной волны испускания 670 нм, причем экспозиционная доза облучения составляла 20 Дж/см².

Результатом данных экспериментов явилось заключение о том, что "Фотохлорин I" и "Фотохлорин II" в небольшой степени, а "Фотосенс" значительно стимулируют клеточное деление, "Фотохлорин III" же, напротив, его подавляет. Следовательно, для "Фотохлорина I", "Фотохлорина П" и "Фотосенса" можно ожидать в определенных условиях эффекта стимуляции опухолевого роста, а для "Фотохлорина III" - заметного цитостатического действия. Однако, для окончательных выводов необходимо проводить исследование различными методами (напимер, путем МТТ-теста и по включению ³Н-тимидина в клеточную ДНК) по крайней мере на двух-трех разных клеточных культурах.

При облучении клеточной культуры, инкубированной с ФС, наступает гибель клеток. Ее можно оценить по величине половинной эффективной концентрации, т. е. такой концентрации, при которой погибает около половины всех клеток. В приведенном здесь примере ФС по эффективности распределяются следующим образом: "Фотохлорин III" > "Фотосенс" > "Фотохлорин I" > "Фотохлорин П". Что касается абсолютных значений, то ФС с цитофототоксичностью менее 20 nM считаются эффективными.

Острая токсичность и пирогенность in vivo
     Обнадеживающие результаты по цитофототоксичности способствовали дальнейшему изучению препаратов на предмет их острой токсичности и пирогенности in vivo. Исследование токсичности проводили на мышах, а пирогенности - на кроликах,(табл.4)после однократного внутривенного введения препаратов в виде 0,5%-ного водного раствора.

При изучении острой токсичности проводили наблюдение за животными, оценивали сроки гибели, число павших животных, клиническую картину интоксикации, поведенческие реакции, макроскопическое состояние внутренних органов павших животных. ЬВзо расчитывали с помощью метода пробит-анализа. Полученные результаты позволяют отнести исследованные ФС к классу соединений "малотоксичные", для которых ЬВ5о (мг/кг) находится в диапазоне 101-1000.

При испытании на пирогенность установлено, что в тест-дозе 1,75 мг ФС на кг массы тела кролика "Фотохлорин П" и "Фотохлорин III" апирогенны. Эта тест-доза соответствует общепринятым дозам для определения пирогенности - 1/20 от терапевтической дозы для человека (35 мг ФС (0,5 мг/кг) - рекомендуемая терапевтическая доза). Для "Фотохлорина I" установлена несколько более высокая пирогенность. Препарат хорошо переносился животными и не вызывал пирогенности в тест-дозе 1,00 мг ФС на кг массы тела животного.

Фармакокинетика
     При введении препаратов внутрибрюшинно мышам с перевитой в мышцу задней ноги эмбриокарциномой Т36 в дозе 40 ("Фотохлорин I") или 50 ("Фотохлорин П") мг/кг наблюдаются следующие закономерности в распределении соединений. После введения препарат попадает в кровь, а затем перераспределяется в органы и ткани животных. Практически во всех органах и в опухоли концентрация ФС достигает своих максимальных значений через 0,5 часа после введения (таблица 5), после однократного внутривенного введения препаратов в виде 0,5%-ного водного раствора.

Отличительной особенностью распределения "Фотохлорина I" в органах является значительное накопление его в тонком кишечнике - в 2,5-5 раз больше, чем в других органах. Однако, этот процесс протекает кратковременно, и уже через 18 часов после введения концентрация в тонком кишечнике уменьшается на два порядка. Индекс контрасности (отношение концентраций в опухоли и окружающей нормальной ткани) равен 3-4. Максимальные различия отмечались через 5 часов после введения препарата.

Отличительной особенностью распределения "Фотохлорина П" в органах является его быстрое накопление в селезенке - в 10-30 раз больше, чем в других органах. Через 2 часа этот препарат перераспределяется в печень и почки, а через 4 часа - в тонкий кишечник и кровь. Однако, данный процесс также протекает кратковременно, и уже через 8 часов после введения содержание препарата в органах и тканях падает более, чем в 10 раз. Индекс контрасности (отношение концентраций в опухоли и окружающей нормальной ткани) равен 8-12. Максимальные различия отмечались через 4 часа после введения препарата. Недостатком этого соединения является его сильное удерживание тканями брюшной полости при внутрибрюшинном введении, из-за чего абсолютные величины накопления в опухоли невелики. Возможно, этот недостаток не будет играть роли при внутривенном введении.

Основной путь выведения препаратов из организма через кишечник. Почки также принимают участие в выведении соединений из организма.
     Подавляющее количество введенной дозы выводится в течение первых суток. Применяемый в настоящее время препарат "Фотосенс" сохраняется в организме в течение более 90 суток, что создаёт значительные трудности при его использовании ввиду опасности светового стресса.

Полученные данные позволяют предположить, что оптимальным временем, по истечении которого можно проводить ФДТ с применением "Фотохлорина I" и "Фотохлорина П", является, соответственно, 5 и 4 часа после введения.

Фотодинамическая терапия
     Изучение фото динамической активности препарата "Радахлорин, 0,35%-ный раствор для внутривенного введения" было проведено на мышах линии Balb/С весом 20-21 грамм с перевитой внутримышечно в бедро задней лапы эмбриокарциномой Т36. Вес опухолей в контрольной и опытной группе в момент эксперимента варьировал от 0,9 до 1 грамма. Процедуру облучения проводили диодным лазером МЛ-500-СП (производства компаний "Милон" и "Сигм Плюс", Россия) через 2 недели после перевивки опухоли. Перед началом облучения была проведена предварительная депиляция кожи в области облучения.

Соединение вводили внутрибрюшинно в дозе 40 мг/кг веса, что соответствует достаточной терапевтической дозе. Для проведения процедуры облучения мыши вводились в эфирный наркоз. Облучение проводили через 5-6 часов после введения ФС. Каждое животное подвергалось однократной процедуре облучения при средней плотности экспозиционной дозы облучения 150 или 300 Дж/см² , после чего проводились наблюдения в течение месяца с регистрацией площади некроза опухолей и общего физиологического состояния.

Наилучшие результаты в виде полного некроза опухоли, образования струпа через 1 неделю после ФДТ и его отпадания через 1,5 месяца наблюдались в группе, получившей световую дозу 300 Дж/см².
     Полученные результаты позволяют констатировать факт наличия выраженной фотодинамической активности данного соединения в экспериментах т in vivo на мышах.

Выводы
     Хлориновые тетрапиррольные фотосенсибилизаторы обладают интенсивной полосой поглощения в длинноволновой области, оптимальным соотношением флюоресценция / интерконверсия и проявляют на порядок большую световую токсичность, чем большинство ФС, при отсутствии темновой токсичности.

Общие токсические свойства при введении хлориновых ФС в организм оказываются лучше, чем у порфириновых олигомеров или сульфированных фталоцианинов, а скорости выведения препаратов из организма не сравнимы: "Фотосенс" и "Фотогем" сохраняются в организме на период более трёх месяцев против 2-х суток у водорастворимых хлориновых ФС.

Максимум накопления препаратов в опухоли наступает через 4-5 часов после введения при терапевтическом отношении 3-4 для "Фотохлорина I" и 8-12 - для "Фотохлорина II".
     "Фотохлорин I" обладает выраженной специфической активностью при ФДТ т у/уо, приводя в эксперименте с животными к полному некрозу опухоли. Этот результат был во многом достигнут благодаря рабочим характеристикам лазера МЛ-500СП (производства компаний "Милон" и "Сигм Плюс", Россия). Таким образом, осуществляемый нами структурно-функциональный поиск позволяет в итоге получать фотосенсибилизаторы с хорошими фотофизическими, биологическими характеристиками и высокой специфической активностью, что создает возможность для получения ФС, наделенного комплексом оптимальных для ФДТ свойств.

Изучение эффективности ФДТ с Фотодитазином – производным хлорина е6
     Изучали эффективность фотодинамической терапии (ФДТ) с фотосенсибилизатором хлоринового ряда Фотодитазином. Фотодитазин - это глюкаминовая соль хлорина еб, хорошо растворимое в воде соединение, длина волны поглощения - 662 нм. Обладает высокой фотодинамической активностью, большим коэффициентом контрастности (отношение концентрации в опухоли и нормальной ткани составляет 10:1), быстрым клиренсом (через сутки в организме остается 6% от введенного количества, через 2 суток)

Изучение эффективности фотодинамической терапии с новым фотосенсибилизатором фотодитазином - производным хлорина еб проведено по 2 протоколам:

1. При первичном и рецидивном раке кожи;
2. С паллиативной целью для реканализации при обтурирующем раке пищевода, кардиального отдела желудка, трахеи, крупных бронхов. В качестве фотосенсибилизатора применяли фотодитазин в дозах от 0,3 до 1,5 мг/кг. Средняя доза составила 0,8 мг/кг. Минимальная эффективная доза - 0,3 мг/кг.

Использовали диодные лазеры «Милон» с выходной мощностью 2,5 Вт, l=662 нм (производство ООО «Сигм Плюс & Милон», Россия) и «Ceralas» (производство фирмы CeramOptek, Германия) с выходной мощностью 1,0 Вт, l=662 нм, а также твердотельный лазер на алюминате иттрия Полюс-2 с выходной мощностью до 2 Вт, l=670 нм (производство НИИ «Полюс», Россия).

Плотность мощности при наружном облучении составляла 0,2 - 0,3 Вт/см², плотность энергии 180 - 240 Дж/см². При ФДТ внутренних органов плотность энергии колебалась от 75 до 275 Дж/см².
     С целью реканализации ФДТ повторяли через 7-14 дней, добиваясь поэтапного восстановления просвета трубчатого органа Из 72 больных 54 проведено по одному курсу ФДТ, 2 курса ФДТ проведено 11, а 3 - 5 курсов ФДТ - 7 больным. Всего 72 больным проведено 104 курса ФДТ: 101 с внутривенным введением фотодитазина, 3-е внутритканевым (таблица 6).

Оценка непосредственных результатов проводилась через 2 месяца после окончания лечения по критериям ВОЗ:

1. Заключение о полной резорбции (ПР) делалось при отсутствии визуальных и пальпаторных признаков опухолевого роста, что подтверждалось негативными результатами морфологических исследовании;
2. Заключение о частичной резорбции (ЧР) делалось в случае уменьшения максимального размера опухолевого узла на 50%, а также когда при клинически полном отсутствии опухоли, морфологические исследования выявляли опухолевые клетки;
3. Уменьшение опухоли меньше чем наполовину или отсутствие изменения размеров опухоли расценивалось как отсутствие эффекта (БЭ).

Результаты применения ФДТ представлены в таблицах 7 и 8. Полная резорбция достигнута у 44 больных, частичная - у 28, включая 15 пациентов, получавших ФДТ с паллиативной целью: 12 с целью реканализации пищевода, кардии, трахеи и бронхов и у 3 с распространенным раком рото- и носоглотки.

Как видно из таблиц, ФДТ с фотодитазином во всех случаях приводила к развитию терапевтического эффекта. Отсутствия эффекта отмечено не было. При проведении ФДТ по радикальной программе у больных первичным и рецидивным раком кожи полная резорбция достигнута в 82,9% случаев. При лечении злокачественных опухолей гортани полная резорбция констатирована в 80% случаев.

При проведении паллиативной ФДТ при обтурирующих опухолях внутренних органов эффект ФДТ выражался в значительном улучшении состояния больных. В результате ФДТ у 8 больных раком пищевода получен выраженный эффект реканализации с восстановлением питания через рот. Трое из них в течение первого месяца прибавили в весе 15-20%. Эффект реканализации сохранялся 3 - 7 месяцев.

У всех больных раком легкого получен выраженный эффект реканализации с ликвидацией одышки и стридорозного дыхания с 3-4 суток после ФДТ. При контрольной бронхоскопии после первого курса ФДТ отмечалось частичное (50%) восстановление просвета бронхов, после 2-3 курса - полное восстановление просвета с рентгенологически определяемой ликвидацией явлений гиповентиляции и ателектаза и восстановлением прозрачности (воздушности) легочной ткани.

Среди больных с рецидивом плоскоклеточного рака языка и слизистой полости рта и рецидивом плоскоклеточного рака носоглотки после лучевой терапии, которым было проведено по 2 курса ФДТ с интервалом 2-2,5 месяца, у одного больного удалось добиться полной резорбции опухоли, и у двух - частичной резорбции. На 104 курса ФДТ отмечено 20 осложнений: озноб - у 18 больных, в том числе у 3 с подъемом температуры тела до 38°С, тошнотой, рвотой; головокружение, слабость у 1 (у пациентки 74 лет); у одного больного на 3 день после ФДТ появился герпес. Озноб у большинства больных был легким, развивался через 20 - 75 минут после введения препарата и длился от 5 до 30 минут.

Заключение
     Быстрое выведение Фотодитазина из организма разрешает проблему кожной фототоксичности, свойственную большинству применяемых в клинике фотосенсибилизаторов.

Благодаря быстрому накоплению в опухоли с высоким градиентом контрастности между опухолевой и нормальной тканью, Фотодитазин позволяет сократить всю лечебную процедуру с нескольких суток до 2 - 3 часов. Это свойство Фотодитазина, наряду с высоким коэффициентом контрастности и имеющимися недорогими портативными надежными диодными лазерами с соответствующей длиной волны света, делает его весьма привлекательным фотосенсибилизатором для ФДТ.

Применение ФДТ с Фотодитазином для лечения рака кожи приводит к наступлению полной резорбции опухоли у 83% больных.
     ФДТ с Фотодитазином можно с успехом применять с паллиативной целью у пациентов с распространенным опухолевым процессом в пищеводе, проксимальном отделе желудка, трахее, крупных бронхах, рото- и носоглотке.

Апробация фотосенсибилизатора «Фотодитазин» для лечения онкологических заболеваний методом ФДТ
     Задачи исследования:

1. Оценить эффективность фотодинамической терапии с препаратом Фотодитазин у экспериментальных животных опухоленосителей в зависимости от:

   - дозы Фотодитазина

   - плотности падающей энергии

2. Выявить наиболее эффективные условия проведения фотодинамической терапии.

Фотодитазин, представляет собой Д - метилглюкоминовую соль хлорина Е6, производится по технологии разработанной профессором Г.В.Пономарёвым из Института биомедицинской химии РАМН.

Работа выполнена на 270 беспородных крысах массой 130-150 г и 20 мышах весом 20-22 г, которым под кожу в область бедра прививали: саркому М-1, рак молочной железы (РМЖ), меланому. Животных брали в опыт на 7-10 сутки после прививки опухоли. Фотодитазин вводили внутрибрюшинно в дозах: 0,5; 2,5; 5,0; 10,0 мг/кг. Перед облучением шерстный покров в зоне опухолевого роста депилировали. Опухоль накротизированных животных облучали через 2,5-3 часа с помощью: лампы АТО-150 (мощность - 0,186 Вт, Я, - 670 нм), полупроводникового диодного лазера для фотодинамической терапии - «Sunny» (мощность - 0,350 Вт, Х-662 нм), лазерного аппарата «Аткус-2» (мощность 0,750 Вт, А,-662 нм). Плотность падающей энергии составляла от 1 50, 200, 300, 400, 600 Дж/см².

Фотодинамический эффект Фотодитазина оценивали на 3, 7, 10, 14, 21 сутки после ФДТ по коэффициенту абсолютного прироста опухоли (К) и по эффекту ингибирования роста опухоли (Рекомендации Фармкомитета по предклинической апробации препаратов, 2000 г.).

Для оценки эффективности ингибирования роста вычисляли средний объем опухоли в группе. Степень ингибирования роста опухоли определяли по показателю торможения роста опухоли ТРО: , где V - средний объем опухоли в см³.

Для определения количественного критерия оценки ингибирующего эффекта кроме ТРО учитывали процент полной регрессии (ПР) опухоли. Количественные критерии оценки ингибирующего эффекта

ТРО <20% 0

ТРО < 20-50% +-

ТРО < 51-80% +

ТРО <81-90% ++

ТРО <91 -100% + < 50% ПР/излечения +++

ТРО <91 -100% + >50% ПР/излечения ++++

Фотодинамическая терапия меланомы мышей
     Специфическая активность 0,5% раствора Фотодитазина исследована на 16 мышах весом 20-22 г с перевитой меланомой под кожу бедра задней лапы. Фотодитазин в дозе 5, 10 мг/кг вводили внугрибрюшинно за 2,5 часа до облучения. Животных, находящихся под наркозом, облучали с помощью аппарата «Suny» (мощность 0,35 Вт, l-662 нм, Е=200,300,400 Дж/см²). Наблюдение за динамикой развития меланомы представлено в таблице 9. Из таблицы видно, что к 18-21 суткам после перевивки в контроле начинается гибель мышей с меланомой. После ФДТ (5 мг/кг, Е=200 Дж/см²) динамика развития опухоли совпадала с таковой в контроле. Увеличение плотности мощности до 300 Дж/см обеспечивало существенное торможение роста меланомы. Коэффициент абсолютного прироста опухоли на 14 сутки был равен практически единице, а в контроле уже на 10 сутки - 46,91. О высокой степени торможения роста меланомы мышей свидетельствуют результаты, полученные после введения Фотодитазина в дозе 10 мг/кг и облучения опухоли световой дозой 400 Дж/см². Результаты экспериментов, выполненных на мышиной меланоме, показывают наличие высокой специфической активности препарата Фотодитазин.

Фотодинамическая терапия рака молочной железы
     С целью выбора оптимального время облучения опухоли молочной железы после внутрибрюшинного введения Фотодитазина было проведено исследование по накоплению препарата в опухоле.

Накопление Фотодитазина в опухоли определяли с помощью спектрометра "ЛЭСА-2" у 5 крыс опухоленосителей РМЖ на 10 сутки после ее перевивки. Интенсивность флюоресценции опухоли регистрировали над центром ее и на границе с окружающими тканями, т.е. по периферии опухоли, через каждые 15 минут на протяжении 2-х часов после введения препарата в дозе 10 мг/кг и оценивали как + -слабое; ++ - хорошее;+++ - отличное(Таблица 10).

Из табл.10 видно, _что отличное (+++) накопление препарата в опухоли наблюдалось через 1 час 15 минут в 3-х случаях из 5, а в 2-х случаях - слабое. В двух случаях зарегистрировано отличное накопление препарата через 1 час 30 минут по всей поверхности опухоли п.1 (голова) и по периферии ее п.З (хвост). В одном случае п.5 (чистая) отличное накопление препарата зарегистрировано через 2 часа. После лазерного облучения флюоресценции в опухолях не обнаружено. Следовательно, время облучения после введения препарата необходимо определять индивидуально. Из-за отсутствия такой возможности в дальнейшей работе мы использовали интервал 2,5-3 часа между введением препарата и облучением опухоли.

Результаты ФДТ рака молочной железы крыс представлены в таблице 11 и рисунке 2, из которых видно, что после фотодинамической терапии наблюдалось достоверное торможение коэффициента абсолютного прироста опухоли по сравнению с контролем.
     Объем опухоли в группе животных, которым вводили Фотодитазин в дозе 5 мг/кг (Е=200 Дж/см²) уменьшился с 97% до 82% (14 сутки). К 21 суткам показатель торможения опухоли снизился до 69%, но при этом вырос процент полной регрессии (60%).
     Увеличение дозы препарата в два раза (до 10 мг/кг) при той же дозе лазерного облучения (200 Дж/см²) или же увеличение дозы лазерного облучения до 300 Дж/см² при той же дозе препарата (5 мг/кг) обеспечило 100% регрессию опухоли РМЖ.

Фотодинамическая терапия саркомы М-1 после внутрибрюшинного введения Фотодитазина
     Кинетика 0,35% Фотодитазина, введенного внутрибрюшинно в дозе 5 мг/кг, прослежена у 3-х крыс на протяжении 1 недели. Накопление препарата определяли с помощью спектрофлюоресцентного комплекса «LESA-6» в центре опухоли и в аналогичных точках по периферии ее. Контролем служила точка на другом бедре. Время накопления препарата имеет индивидуальные колебания, которые в среднем укладываются в промежутке 2,5—6 часов. Учитывая полученные данные облучение саркомы М-1 проводили через 2,5-3 часа после введения Фотодитазина в дозах: 0,5, 2,5, 5, 10 мг/кг (таблицы 12,13; рисунок 3).

Анализ результатов исследования выявили 5 наиболее эффективных вариантов доз препарата и падающей энергии для ФДТ (2,5 мг/кг и 5,0 мг/кг - 300 и 600 Дж/см²). 4 из них имеют одинаково высокий ингибирующий эффект (++++). В пятом варианте - 10мг/кг; 300 Дж/см² выявлен наиболее высокий процент полной регрессии опухоли, но при этом процент торможения роста опухоли не позволяет высоко оценить ингибирующий эффект данного варианта. Процент торможения роста опухоли и процент полной регрессии на 21 сутки представлены на рис.4, 5.

На основании представленного материала можно сделать выводы:

1. Фотодитазин является высокоэффективным фотосенсибилизатором для проведения фотодинамической терапии.
2. Эффективность Фотодитазина зависит от дозы препарата и плотности падающей энергии.
3. Наиболее выраженный противоопухолевый эффект получен при дозе препарата 2,5 и 5 мг/кг, Е=300, 600 Дж/см².
4. Самая малая и эффективная для ФДТ доза препарата и доза энергии из исследованных нами - 2,5 мг/кг, 300 Дж/см².

Заключение
     Фотодитазин активно накапливается в опухоли экспериментальных животных. В опухоли молочной железы крыс наибольшее накопление зарегистрировано через 1 час 15 минут - 2 часа, в саркоме М-1 - через 2,5 - 3 часа.

Результаты фотодинамической терапии, выполненные с Фотодитазином, свидетельствуют об отличном ингибирующем эффекте при введении в дозе 2,5, 5 мг/кг и облучении с плотностью мощности 300, 600 Дж/см².
     Таким образом, результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод о том что, Фотодитазин является высокоэффективным фотосенсибилизатором.

Динамика роста саркомы М-1 после фотодинамической терапии с Фотодитазином и с последующим применением фитококтейля Формула -1 и Формула-2
     Выполнено 4 группы эксперимента, в каждой группе было по 8 животных. Животным I-III групп провели ФДТ с Фотодитазином. Животным I группы после ФДТ давали фитококтейль Формула-1, II группе животных после ФДТ давали фитококтейль Формула-2, III группе животных проведена только фотодинамическая терапия, IV группа - интактные опухоленосители саркомы М-1 (контроль).

ФДТ проводили через 3 часа после внутрибрюшинного введения Фотодитазина в дозе 5 мг/кг, при плотности падающей энергии 300 Дж/см², на следующие сутки и до конца наблюдения животные получали ежедневно фитококтейль Формула-1 или Формула-П через зонд в дозе 0,1 мг/100 г массы животного и 0,1 мл/100г в поилку.

Из таблицы 14 и рисунка 6 видно, что во всех группах на все сроки исследования наблюдается достоверное снижение коэффициента абсолютного прироста опухоли. Высокий процент торможения опухоли отмечен во всех группах до 14 суток (от 95% до 99%), отсутствие опухолевого роста зарегистрировано от 62% до 75%, ингибирующий эффект (I i i I) оценивается как высокий.

К 28 суткам лучшие результаты в лечении саркомы М-1 наблюдаются в группе с ФДТ+Формула-2 (самый низкий коэффициент абсолютного прироста опухоли 1,02 по сравнению с другими группами опыта), самый высокий процент торможения опухоли 99%, самый высокий процент полной регрессии 75% и соответственно ингибирующий эффект. В группе ФДТ+Формула-1 начиная с 21 суток (рис.6) коэффициент абсолютного прироста опухоли выше, чем в двух других опытных группах. Ингибирующий эффект (++) оценивается как удовлетворительный в связи со снижением процента торможения роста опухоли (86%) и процента полной регрессии опухоли (50%).

В группе ФДТ процент полной регрессии опухоли также падает (от 50% до 43%), однако процент торможения роста остается высоким (97%) и соответственно ингибирующий эффект остается хорошим (+++).
     Таким образом применение коктейля Формула-2 повышает результаты фотодинамической терапии. Применять коктейль Формула-1 сразу после ФДТ, по-видимому, не следует, поскольку рост опухоли усиливается по сравнению с результатами ФДТ без применения коктейля.

ФДТ рака с использованием фотосенсибилизатора «Радахлорин»
     Впервые водорастворимые производные хлорофилла для медицинских целей были использованы Е. Snyder (США) в 1942 г., и со временем они стали применяться для профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний, атеросклероза, ревматоидного артрита.

В научной литературе об использовании производных хлоринового ряда для фотодинамической терапии было заявлено в 1986 г., после чего группа авторов из США (J. Bommer, Z. Sveida и В. Burnham) создала моно-1_-аспартил хлорин е₆ (МАСЕ), который в настоящий момент находится на завершающей стадии клинических испытаний в Японии.
     В 1994-2001 гг. в России была разработана технология извлечения из растительного сырья комплекса биологически активных хлоринов, которые содержат в качестве основного компонента хлорин е₆, фотоцитотоксическое действие которого на опухоль усиливается, а общие фармакологические показатели улучшаются за счет двух других природных хлоринов, содержащихся в экстракте. Хлорины, в виде 7%-ного водного раствора, представляют собой субстанцию "Радахлорин", используемую для приготовления различных лекарственных форм, в том числе раствора радахлорина для внутривенного введения и геля радахлорина для наружного применения. Данные препараты запатентованы и производятся ООО "РАДА-ФАРМА" (Москва, Россия) совместно с ООО "Фирма ГЛЕС" (Москва, Россия) и Российским онкологическим научным центром им. Н. Н. Блохина РАМН и в 2000 г. перешли на стадию ограниченных клинических испытаний у добровольцев и пациентов с неотложными жизненными показаниями.

"Радахлорин" содержит композицию из трех циклических тетрапирролов хлориновой природы (с гидрированным кольцом D), основной из которых (80-90 %) - хлорин е₆ (рис.7, 8). В дополнение к нему имеется ФС, обладающий способностью с высокой избирательностью накапливаться в неопластических образованиях и абсцессах, а также возможен примесный компонент (<5 %). Для "Радахлорина" характерна высокая водорастворимость и хорошая стойкость при хранении. Хранение Радахлорина в темноте при 4-8 °С не меняет его свойств в течение полутора лет.

1. Фотофизические свойства Радахлорина

Фотосенсибилизаторы (ФС) обладают способностью поглощать свет в видимой области, результатом чего является их фотоактивация и последующая релаксация возбужденного состояния с переносом энергии на растворенный в тканях молекулярный кислород и органические субстраты. Последнее приводит к окислительным и свободнорадикальным процессам в биологических тканях, их повреждению и последующему разрушению (некрозу). Наиболее предпочтительной для ФДТ полосой возбуждения является самая длинноволновая полоса поглощения конкретного ФС (таблица 15, рис. 9), т.к. с ростом длины волны растет проникающая способность света в биологические ткани.
     В первую очередь для соединений с предполагаемой биологической активностью нами исследуются их фотофизические свойства в различных средах.

"Радахлорин" способен разрушать биологические субстраты после возбуждения светом с длиной волны 654 - 670 нм, чему соответствует эффективная глубина проникновения света в ткани до 7 мм (рис.9).

Высокая степень фототоксичности "Радахлорина" связана с высоким квантовым выходом интерконверсии (таблица 16), что коррелирует с высоким квантовым выходом синглетного кислорода - одного из основных токсических агентов, образующихся под действием света при ФДТ. Сохраняющаяся при этом способность препарата флюоресцировать оставляет возможность для люминесцентной диагностики очагов неопластического изменения тканей. Для этого препарат возбуждают в любой из полос - 406, 506, 536, 608 или 662 нм и регистрируют интенсивную флюоресценцию при 668 нм.

2. Результаты биологических испытаний
     2.1. Исследование цитотоксичности и цитофототоксичности in vitro

Представленные в таблице 17 данные позволяют предположить, что в отсутствие облучения лазером для "Радахлорина" в небольшой степени, а "Фотосенса" - в значительной характерно проявление цитотоксической активности.

При облучении лазером клеточной культуры, инкубированной с ФС, наступает гибель клеток. Цитофототоксичность соединений принято оценивать по величине концентрации в микромолях (mМ) препарата, при которой погибает 50 % всех клеток (ЕС₅₀). В приведенном здесь примере ФС по эффективности распределяются следующим образом: "Радахлорин"³"Фотосенс". Что касается абсолютных значений, то ФС с цитофототоксичностью менее 20 mМ считаются эффективными.

2.2. Острая токсичность и пирогенность in vivo
     Обнадеживающие результаты по цитофототоксичности способствовали дальнейшему изучению "Радахлорина" в опытах in vivo.
     Исследование токсичности проводили на мышах F₁(CBAxC₅₇BI_T/6), а пирогенности - на кроликах (таблице 18). "Радахлорин, 0,35%-ный раствор для внутривенного введения" вводили внутривенно одноразово.

При изучении острой токсичности проводили наблюдение за животными, оценивали сроки гибели, число павших животных, клиническую картину интоксикации, поведенческие реакции и макроскопическое состояние внутренних органов павших животных. LD₅₀ рассчитывали с помощью метода пробит-анализа. Полученные результаты позволяют отнести "Радахлорин" к классу соединений "малотоксичные", для которых LD₅₀ находится в диапазоне 101-1000 мг/кг.

При испытании на пирогенность установлено, что в тест-дозе 0,70 мг/кг массы тела кролика "Радахлорин" апирогенен. Эта тест-доза соответствует общепринятым дозам для определения пирогенности -1/20 от терапевтической дозы для человека.

2.3. Фармакокинетика
     При введении препарата "Радахлорин, 0,35%-ный раствор для внутривенного введения" внутрибрюшинно мышам с 'перевитой внутримышечно эмбриокарциномой Т36 в дозе 40 мг/кг наблюдаются следующие закономерности в его распределении. После введения препарат попадает в печень, а затем в кровь, после чего он перераспределяется в органы и ткани животных (таблице 19). При внутривенном введении препарата в дозе 20 мг/кг были получены аналогичные закономерности биораспределения.

Максимум накопления субстанции в опухоли (0,70 mМ) достигается через 5 часов после внутрибрюшинного введения в дозе 40 мг/кг и длительно сохраняется (18-24 часа). Опухолевая концентрация субстанции через 18 часов после введения препарата составляет 0,48 (iM, что всего в 1,5 раза меньше, чем в абсолютном максимуме накопления, при высокой селективности накопления. Отношение опухоль/мышечная ткань через 18 часов составляет 32, а опухоль/кожа - 44.

После внутривенного введения препарата в дозе 20 мг/кг максимум накопления в опухоли регистрируется через 0,5 часа (0,32 иМ) и также длительно сохраняется (до 5 часов). Максимальная контрастность накопления при внутривенном введении проявляется через 3 часа и составляет для опухоли/мышечной ткани 3, а опухоли/кожи - 4.
     Препарат выводится из организма через сутки на 94%.

3. Фотодинамическая терапия
     Изучение фотодинамической активности препарата "Радахлорин, 0,35%-ный раствор для внутривенного введения" было проведено на мышах линии Balb/C массой 20-21 г с перевитой внутримышечно в бедро задней лапы эмбриокарциномой Т36. Вес опухолей в контрольной и опытной группе в момент эксперимента варьировал от 0,9 до 1 г. Процедуру облучения проводили через 2 недели после перевивки опухоли. Перед началом облучения была проведена предварительная депиляция кожи в области облучения.

Соединение вводили внутрибрюшинно в дозе 40 мг/кг массы, что соответствует достаточной терапевтической дозе. Для проведения процедуры облучения мыши вводились в эфирный наркоз. Облучение проводили через 5-6 часов после введения ФС. Каждое животное подвергалось однократной процедуре облучения при средней плотности экспозиционной дозы облучения 150 или 300 Дж/см², после чего проводились наблюдения в течение месяца с регистрацией площади некроза опухолей и общего физиологического состояния. Наилучшие результаты в виде полного некроза опухоли, образования струпа через 1 неделю после ФДТ и его отпадания через 1,5 месяца наблюдались в группе, получившей световую дозу 300 Дж/см². Полученные результаты позволяют констатировать факт наличия выраженной фотодинамической активности данного соединения в экспериментах in vivo на мышах (рис. 11).

4. Первые клинические результаты
     В клинике общей хирургии Челябинской государственной медицинской академии (ЧГМА) на базе городской клинической больницы № 1 метод ФДТ применен у 35 больных (15 мужчин и 20 женщин) для лечения злокачественных опухолей кожи, молочной железы, желудочно-кишечного тракта, женских половых органов.

По одному курсу проведено у 33 больных, по два курса у 3 больных, по три курса у одного больного (табл. 20).
     У восьми пациентов ФДТ злокачественной опухоли проводилась в связи с наличием противопоказаний к традиционным методам лечения: возрастные изменения, тяжелые сопутствующие заболевания. У 58,2 % пациентов опухоли имели I и II стадии, в четырех случаях было первично-множественное поражение одного или нескольких органов.
     Часть больных (5 человек, 137 опухолей) ранее лечились общепринятыми методами (хирургическая операция, лучевая-, химия-, криотерапия), и возможности указанных методов при лечении остаточной опухоли, рецидива или метастазов были исчерпаны. У данных больных ФДТ производилась не ранее чем через один месяц после лучевой или лекарственной терапии.

Эффективность ФДТ оценивалась по данным визуального, эндоскопического, рентгенологического, ультразвукового и цитоморфологического методов исследований.
     Использовались четыре методики лазерного облучения:

1. Дистанционное, поверхностное облучение - с оптического торца световода или через микролинзу.
2. Внутриполостное.
3. Внутритканевое.
4. Сочетание поверхностного и внутритканевого.

В случаях 2-4 использовались различные световоды и диффузоры. Лечение производилось под местной анестезией или внутривенном наркозом.
     Эффективность ФДТ оценивалась непосредственно после окончания сеанса, через 1-2 суток, на седьмой, пятнадцатый, тридцатый день и затем ежемесячно (рис.12).

В период от 1 до 7 дней фотохимическая реакция различной степени выраженности была выявлена в 100 % случаев.
     О развитии в опухоли фотоцитотоксической реакции свидетельствовали: отек и гиперемия в зоне облучения, нарушение кровообращения с некрозом опухоли.

Рис. 12. Динамическое наблюдение больной с диагнозом "базалиома"
а. До операции (слева).
б. Через 2 часа. В области правой щеки на месте базалиомы появился отек и легкая гиперемия на участке до 1,5 см. Самочувствие больной и температура нормальные (справа).
в. Через 1 сутки. Отек в области правой щеки увеличился (3x2 см). В зоне базалиомы появилась темно-коричневая поверхностная сухая корочка (слева).
г. Через 7 суток. Отек в области щеки незначительный, на месте базалиомы струп темно-коричневого цвета размером 5x7 мм. Самочувствие больной оставалось хорошим, температура тела в течение 7 дней оставалась нормальной (справа).
д. Через 4 недели (14.11.2000 г.). В щечной области справа на месте базалиомы имеется плотный поверхностный струп темно-коричневого цвета диаметром 0,7 см. Вокруг имеется узкая полоска гиперемии. Отека нет, инфильтрации окружающих тканей нет. Пальпация безболезненная. Температура тела нормальная (слева).
е. Через 6 недель (28.11.2000 г.). На месте бывшей базалиомы сформировался поверхностный нежный малозаметный слабопигментированный рубчик размером 3x4 мм. Отека и инфильтрации ткани щеки нет (справа).

Заключение
     Полная резорбция опухоли (базалиомы) с хорошим косметическим эффектом.
     Таким образом, фотодинамическая терапия с использованием лазерного диодного модуля с длиной волны 662 нм в сочетании с препаратами "Радахлорин, 0,35%-ный раствор для внутривенного введения" и "Радахлорин, 0,1%-ный гель для наружного применения" дает полную резорбцию опухоли (базалиомы) с хорошим косметическим эффектом. Положительные результаты также имеются при лечении многих других нозологии злокачественных новообразований.

5. Выводы
     Хлориновые тетрапиррольные фотосенсибилизаторы обладают интенсивной полосой поглощения в длинноволновой области, оптимальным соотношением флюоресценция/интерконверсия и проявляют на порядок большую световую токсичность, чем большинство ФС, при отсутствии темновой токсичности. Общие токсические свойства при введении хлориновых ФС в организм оказываются лучше, чем у порфириновых олигомеров или сульфированных фталоцианинов, а скорости выведения препаратов из организма не сравнимы: "Фотосенс" и "Фотогем" сохраняются в организме на период более 3 месяцев против 2 суток у водорастворимых хлориновых ФС.

Осуществляемый нами структурно-функциональный поиск позволяет получать фотосенсибилизаторы с хорошими фотофизическими, биологическими характеристиками и высокой специфической активностью, что создает возможность для получения ФС, наделенного комплексом оптимальных для ФДТ свойств.
     Препарат "Радахлорин, 0,35%-ный раствор для внутривенного введения" обладает рядом преимуществ по сравнению с другими препаратами для ФДТ:

1. Достижение высокого (0,70 \mМ) максимума накопления в опухоли через 5 часов после внутрибрюшинного введения в дозе 40 мг/кг и длительное его сохранение (18-24 часа). Опухолевая концентрация через 18 часов после введения составляет 0,48 у.М, что всего в 1,5 раза меньше, чем в абсолютном максимуме накопления, при исключительно высокой селективности накопления. Отношение опухоль/мышечная ткань через 18 часов составляет 32, а опухоль/кожа - 44.
2. Постижение высокого (0,32 \mM) максимума накопления в опухоли через 0,5 часа после внутривенного введения в дозе 20 мг/кг и длительное его сохранение (до 5 часов). Максимальная контрастность накопления при внутривенном введении проявляется через 3 часа и составляет для опухоли/мышечной ткани составляет 3, а опухоли/кожи - 4.
3. Быстрое выведение препарата из организма: через сутки - 98 %.
4. Высокая фотодинамическая активность препарата in vivo при низкой цитотоксичности.

В результате проведения ФДТ с "Радахлорином, 0,35%-ным раствором для внутривенного введения" получено увеличение средней продолжительности жизни в опытной группе животных, облученной лазерным излучением 300 Дж/см², почти в 2 раза при выраженной деструкции опухолей. Этот результат был во многом достигнут благодаря рабочим характеристикам лазера ML500-SP.
     Свойства "Радахлорина" позволяют радикально изменить саму технологию ФДТ в онкологической клинике, поскольку можно исключить этап продолжительного пребывания в стационаре, необходимый при использовании "Фотофрина-И", "Фотогема" или "Фотосенса", заменив его однодневным стационаром или даже амбулаторным лечением.

Оптимальным временем для облучения опухолей лазерным излучением в клинике можно считать интервал 0,5-3 часа (при внутривенном введении).
     Фармакопейные статьи предприятия-производителя ООО "Радафарма" на лекарственную субстанцию "Радахлорин" и 2 лекарственные формы: "Радахлорин, 0,35%-ный раствор для внутривенного введения" и "Радахлорин, 0,1%-ный гель для наружного применения" (совместно с ООО "Фирма ГЛЕС", НИИ ЭДиТО РОНЦ РАМН) зарегистрированы департаментом по новым лекарственным средствам и находятся на этапе оптимизации параметров.

Фармакопейные статьи предприятия-производителя ООО "Радафарма" на лекарственную субстанцию "Радахлорин" и 2 лекарственные формы: "Радахлорин, 0,35%-ный раствор для внутривенного введения" и "Радахлорин, 0,1%-ный гель для наружного применения" (совместно с ООО "Фирма ГЛЕС", НИИ ЭДиТО РОНЦ РАМН) зарегистрированы департаментом по новым лекарственным средствам и находятся на этапе оптимизации параметров.